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撰文 | 望夜
线粒体是真核细胞代谢和产能的中心。目前,人们认为线粒体很可能来自古代变形菌和真核祖先的共生事件【1】,并演化至今。如今,线粒体中仍有原核祖先的基因组残留物。例如,人源线粒体可以编码13种蛋白质,而其他组分蛋白则由核基因组编码。它们可能在10多亿年的漫长进化中逐渐从线粒体基因组迁移或添加到核基因组中。
经过几十年的系统研究,科学家们已经建立了出线粒体核心蛋白组分,并将这些蛋白质的功能障碍与150多种不同的疾病联系起来。但是仍有数百种线粒体蛋白的特征缺乏理解或完全未知,约40%的线粒体相关疾病的分子机制未知,严重阻碍了这些疾病的诊断和药物开发,使相关患者长期处于无药可用状态。
2022年5月25日,为建立完整的人源线粒体功能谱,华盛顿大学医学院David J. Pagliarini研究小组和Morgridge研究所Joshua J. Coon课题组合作在Nature杂志发表题为Defining mitochondrial protein functions through deep multiomic profiling研究文章,利用CRISPR介导的200多个单倍体HAP1细胞敲除株,获得细胞对线粒体扰动的深入分析,提供蛋白质功能的机制认知。
本文以Pagliarini课题组之前发表的集成系统生化方法为基础【2】,通过改进高通量定量质谱,将其应用于酿酒酵母中线粒体未知蛋白质(MXP)的功能研究【3】。在本文中,作者进一步优化了该方法,并用于分析203株HAP1细胞株。它们都通过CRISPR-Cas9系统去除了核染色体中的线粒体蛋白编码基因,包括50个代码MXP和66个代码功能部分揭示的哨兵蛋白,其中大部分对应于某种人类疾病。
作者对每个细胞株的生长率进行了监测,并使用高分辨率质谱进行了分析,共进行了大约3200次气相色谱-液相色谱-质谱分析(图1),产生约8.3m的定量数据。作者对每个细胞株的生长率进行了监测,并使用高分辨率质谱进行了分析,共进行了大约3200次气相色谱-液相色谱-质谱分析(图1),产生约8.3m的定量数据。作者鉴定了8433种蛋白质、3563种脂质和每个细胞株218种代谢物。对多组学数据进行简单的分子中心分析,可以验证蛋白质已知的生物学功能,并提示其潜在的新功能。例如,脯氨酸合成中的关键酶ALDH18A1必然导致脯氨酸不足;然而,当线粒体NAD激酶NADK2被敲除时,也会导致类似的脯氨酸缺乏。类似地,脂质数据显示缺乏TAZ和CPT2
心磷脂和酰基肉碱在细胞中发生意外变化;但在线粒体融合调节蛋白质
MFN2
线粒体接触点和脊组织系统成员的缺失(MICOS)或
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图1 本研究的实验过程概述
蛋白质组数据也可用于发现新的生物学机制。最突出的例子之一是对推测的锌离子转运蛋白SLC30A9的分析。作者发现,敲除
SLC30A9
导致核糖体和氧化磷酸化蛋白在线粒体中大量流失。近期冷冻电镜研究表明,线粒体核糖体有罕见的锌离子结合基序,参与结构稳定,与亚基相互作用
【4】
。相应地,作者发现,在SLC30A9敲除细胞株中,6种线粒体DNA编码的氧化磷酸化亚基蛋白含量显著降低,其作用相当于线粒体核糖体哨兵蛋白MRPS22敲除。以上分析结果通过免疫杂交进一步验证。结合早期研究的基础【5-6】,作者得出结论,SLC30A9是一种锌离子相关转移蛋白,在线粒体核心生理过程中起着关键作用。辅酶Q或许多诊断为线粒体功能障碍的患者经常出现线粒体复合物I
(
CI
)缺失,作者将重点关注数据中与两者相关的蛋白质。首先是缺乏辅酶Q,作者锁定了PIGY上游开放阅读框(
PYURE
),最近的研究发现,它参与了线粒体修复【7】,但其他信息未知。PYURE敲除株中二氢乳清酸水平提高,这就要求辅酶Q将其转化为乳清酸。有趣的是,当作者检索CI缺失的相关蛋白质时,PYURE也排名第一,表明它可能参与桥接相关的生理过程。
为了进一步确定PYURE与这些代谢过程的联系,作者分析了PYURE去除细胞株的全蛋白组结果,发现了三种辅酶Q相关蛋白(COQ3、COQ5、COQ7和三个CI组装因子(AF3)、AF5、AF8)明显下降。其他CI亚基也有所减少,特别是参与构成辅酶Q组合的CI 亚基Q模块。此外,作者还在HEK293细胞中验证了上述功能,并排除了上述现象
PYURE
在同一多顺反子上
PIGY
可能的驱动。作者进一步回顾了之前的研究结果【5】,发现PYURE只与AF5和COQ5相互作用,然后与AF8和其他辅酶Q蛋白相互作用。它们都属于依赖S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶(SAM-MT)家族建议PYURE通过Trm112样的结构域选择性地结合家族的一些成员。作者确认PYURE可以直接与AF5结合,结合点位于Trm112样的结构区域;进一步确认PYURE结合AF5不影响其基本结合点或催化能力,而是通过稳定其结构来延长其半衰期。因此,作者认为PYURE结合了相互连接的CI和辅酶Q通道,稳定了SAM-MTs,建议将其重新命名为NDUFAFQ。
接下来,作者希望探讨PYURE是否与线粒体相关疾病有关。作者发现一个出生时患有代谢性酸中毒的孩子,但他的父母和另一个孩子没有生病。作者通过无偏全外显子测序分析锁定
PYURE
第二个外显子中的移码突变是唯一可能的遗传因素,患者的等位基因突变。由于患者的细胞无法直接获得,作者通过工程手段将突变引入HAP1细胞,发现突变细胞非常接近PYURE敲除株,即辅酶Q和CI相关蛋白质大量丢失;纯化PYURE突变对AF5的亲和力显著降低。因此,作者认为是这样PYURE突变很可能是这种疾病表型的分子病因。这个例子表明,MITOMICS数据可以帮助分析线粒体中孤儿蛋白的功能,并找到一些罕见病因。
MITOMICS数据还能提供哪些信息?作者认为可以用来确定MXP蛋白的功能。作者利用适合高维数据可视化的作者
t
-嵌入分析领域(t-SNE)深入分析数据,发现氧化磷酸化和线粒体核糖相关蛋白质的集群,包括天冬氨酸、磷脂酰胆碱和MXP等未知蛋白质 C16orf91、C18orf21、GTPBP8暗示这些蛋白质以一些尚未澄清的方式参与相关通道。作者进一步扩展了这一关联推定分析,确定了DHRS4桥接粒体和过氧化物酶体中的脂肪代谢、C14orf159在丙酰辅酶A代谢中的作用等一系列MXP功能。此外,作者还分析了集群外的离散点作为补充。主要针对多个基因分子之间的相互关系,如MXP,只有在某个敲除株中变化显著的分子(包括蛋白质、脂质和代谢物) RAB5IF与TMC01有很强的相关性。蛋白质组数据显示,TMC01在RAB5IF敲除株中明显而特异地减少,并通过western blot确认;在TMC01敲除株中,RAB5IF也减少了。RAB5IF和TMC01的确切功能仍然模糊不清。最近的研究表明,TMC01是一种线粒体蛋白【8】,也是一种内质网(ER)易位子【9】或通过外排防止ER钙离子过载的ER通道【10】。但在RAB5IF敲除株响应thapsigargin时,本文作者未能观察到钙离子释放的变化。RAB5IF最近被注释为线粒体呼吸链组装因子【11】
,但作者未能在敲除株中观察到呼吸链蛋白的减少。尽管存在上述差异,但公认的是
TMC01
突变会导致脑胸发育异常(cerebrofaciothoracic dysplasia),又称颅面畸形、骨骼异常、智力低下综合征(CFSMR)
【12】
。由于上述RAB5IF与TMC01的强相关性,作者推测RAB5IFCFSMR也可能导致一些病因不明的突变。
通过对上述报告中未知家庭的测序数据进行分析
【12】
,作者确定了位于20号染色体上的11个不同纯合区域RAB5IF所在区域。测序显示RAB5IF的第一个外显子有一个纯合的无意突变C.75G>A(p.Trp25*),这种突变可能会导致蛋白质过早被切断;患者家中其他五名无症状成员没有纯合突变,但唇腭裂的两名家庭成员在该位置有杂合突变。为了进一步分析突变的发生,作者利用患者样品建立了纤维细胞培养物,确认细胞中RAB5IF和TMC01的缺失。将野生RAB5IF-GTP转移到上述细胞中,显著恢复TMC01的表达水平。结果表明,RAB5IF的缺陷是这类患者临床表现的原因。回顾本文,作者通过基于质谱的多组学分析手段,对线粒体相关蛋白质的新功能进行了深入研究,获得了一系列发现:
PIGY
上游开发阅读框(PYURF)依赖于S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶伴侣,可同时支持呼吸链复合物I组装和辅酶Q合成,其突变可能导致以前不为人知的多系统线粒体障碍。确认SLC30A9是一种锌离子转移蛋白,并与线粒体中的核糖体和氧化磷酸化的完整性建立联系。确认SLC30A9是一种锌离子转移蛋白,并与线粒体中的核糖体和氧化磷酸化的完整性建立联系。确认RAB5IF是第二次突变后脑胸发育异常的基因。本文获得的数据可以为缺乏强有力实验证据支持的各种线粒体孤儿蛋白提供可能的生物功能提示,发现线粒体功能障碍时丰富的细胞特征可用于线粒体疾病的遗传诊断。上述数据现在可以通过MITOMICS通过.app在线交互(资源网站httpss)://www.mitomics.app)。
原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04765-3
制版人:十一
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