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聚合酶链反应（PCR）它是一种分子生物学技术，用于扩大特定的DNA片段，可视为生物体外的特殊DNA复制，PCR最大的特点是微量DNA指数倍增。参与PCR反应的五种物质是:引物、酶、DNTP、模板、Mg2 ，实验设计应注意以下几点：
- PCR的五要素及其条件引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产品的特异性取决于引物与模板DNA的互补性。理论上，只要知道任何模板DNA序列， 可以根据其设计的互补寡核苷酸链作为引物，模板DNA可以通过PCR在体外大量扩展。设计引物应遵循以下原则：
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1引物长度 |
15-30bp，常用为20bp左右。 |
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2引物扩大跨度 |
200-500bp在特定条件下可扩展至10bp的片段。 |
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3引物碱基 |
G C含量为40-60%，扩增效果不好，过多容易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免排列超过5种嘌呤和嘧啶核苷酸。 |
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44避免引物内的二级结构 |
避免引物内部的二级结构，避免两个引物之间的互补性，特别是3'；端部互补，否则会形成引物二聚体，产生非特殊的扩增条带。 |
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5引物3端的碱基 |
引物3'；端碱基，特别是最后和倒数第二碱基，应严格要求配对，避免因端碱基不配对而导致PCR失败。 |
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6酶切位点 |
适当的酶切位点可以添加到引物中， 扩展靶序列最好有合适的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆有好处。 |
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7特异性 |
引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。引物量：每个引物浓度0.1～1umol或10～100pmol，最好产生最低引物量所需的结果，高引物浓度会导致不匹配和非特异性扩大，增加引物之间形成二聚体的机会。 |
注：bp即base pair，1345 bp DNA ，也就是说，有1345个碱基对DNA;base pair 指示DNA碱基对数的数量
DNA分子为双链结构 有四种碱基，即鸟嘌呤(G),腺嘌呤(A),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T) ,其中G与C配对, A与T配对, 10bp也就是说，两条链上有10个碱基 根据排列组合，可以得出4-10种组合形式的结论 。
- DNTP的质量和浓度是PCR的五要素及其条件
dNTP质量与浓度和PCR扩增效率密切相关，dNTP粉末呈颗粒状，如果保存不当，易变性就会失去生物活性。
- DNTP的质量和浓度是PCR的五要素及其条件
dNTP质量与浓度和PCR扩增效率密切相关，dNTP粉末呈颗粒状，如果保存不当，易变性就会失去生物活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配制成高浓度M NaOH或1M Tris。HCL将缓冲液的PH调节到7.0～7.五、小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会降解DNTP。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，特别是注意四种DNTP的浓度应相等( 等待摩尔制备)，如果其中任何一种浓度不同于其他几种(高或低)，就会导致错配。过低的浓度会降低PCR产品的产量。dNTP能与Mg2 结合，使游离Mg2 浓度降低。
- PCR的五要素及其条件模板(靶基因)核酸
模板核酸的量和纯化程度是PCR成败的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常使用SDS和蛋白酶K来消化标本。SDS其主要功能是：溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，从而溶解膜蛋白，破坏细胞膜，解离细胞中的核蛋白，SDS 它还可以与蛋白质结合沉淀；蛋白酶K可以水解和消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，然后用有机溶剂酚和氯仿提取蛋白质和其他细胞成分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸可作为PCR反应的模板。一般临床检测标本可以通过快速简单的方法溶解细胞，裂解病原体，消化去除染色体的蛋白质，游离靶基因，直接用于PCR扩张。RNA异硫氰酸胍或蛋白酶K法通常用于模板提取，以防止RNase降解RNA。
- PCR的五要素及其条件Mg2 浓度
Mg2 对PCR扩张的特异性和产量有显著影响，在一般PCR反应中，各种DNTP浓度为200umol/L时，Mg2 浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2 浓度过高，反应特异性降低，非特异性增加，浓度过低Taq DNA聚合酶的活性降低了反应产物。
PCR反应的主要步骤
标准PCR过程分为三个步骤：
DNA变性（90℃-96℃）：在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA模板DNA
退火（60℃-65℃）：
降低系统温度，将引物与DNA模板结合，形成局部双链。
延伸（70℃-75℃）：
Taq酶(72)℃在DNTP的作用下，以DNTP为原料，从引物3开始′端开始以从5′→3′延伸端方向，合成DNA链，补充模板。
每个循环都经过变性、退火和延伸，DNA含量翻了一番。
PCR扩展反应条件如下:94°C预变性10 min；94°C变性0.5 min；55°C退火0.5 min (退火温度根据引物长度和TM值确定)；72°C延伸1 min (延伸时间取决于目的片段的长度，调整)；30~32个循环 (根据目的片段扩展的难度)；最后72°C延伸10 min，降温到25°C预保存5 min。
PCR常用设置如下：
预变性 94℃ 2min
变性 94℃ 30s
退火 59℃ 30s延伸 72℃ 1min
循环数 30 cycles
后延伸 72℃ 10min
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