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炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎在内的肠道非特异性慢性炎症(UC)和克罗恩病(CD),病因不明确,多与环境、遗传、感染、免疫等因素有关。目前治疗以抗炎、抑制免疫为主,但治疗过程中可能会出现复发、副作用,如过敏、粒细胞减少等。研究发现,适当的治疗可以使约50%-60%的患者对药物治疗有反应,20%-30%可以保持缓解。
大蒜是日常生活中常见的食物,被认为具有抗感染作用。胃肠道肿瘤的相对风险在大蒜消耗量高的人群中有所下降。Annexinexinexinexinine可以促进肿瘤细胞的凋亡,并引起各种不同蛋白的表达。 Ⅰ、Galectin、VDAC-1等。大蒜素是大蒜提取物,具有较高的安全性。研究发现它具有抗炎、促进凋亡和抗肿瘤的作用。可抑制肿瘤细胞SW620、HCT116的生长也抑制了NF-κB(?)舌化。NF-κB也是IBD的关键环节,大蒜素可以通过NF使用-κB发挥抗炎作用。选择和建立合适的动物模型是研究药物治疗不可缺少的方法。动物模型的制作方法多种多样,化学诱导是广泛而稳定的方法之一。TNBS灌肠法是可引起经典慢性结肠炎的经典方法之一。从免疫类型分类的角度来看,它类似于人类CD[5、6],诱导后可产生持续的炎症性病变。
为了验证体内大蒜素的抗炎作用,首先建立了大鼠结肠炎模型,通过药物干预后各种炎症指标的检测来评价治疗效果。为了进一步研究大蒜素的抗炎机制,我们选择了人类结肠腺癌上皮Caco-2细胞进行研究。它能在体外培养和生长融合后自发分化形成极性,表现出成熟肠上皮细胞的形态结构和功能特征,是研究结肠上皮蛋白表达及其功能的理想细胞。在IBD的发生和进展过程中,NF-κB在这条路的下游起着重要的作用。IKB磷酸化可由多种炎症因子激活,亚基p65可激活并移入细胞核。它的活化可以使IL-1β、TNF-α基因转录增强和高表达,可以再次激活NF-κB。IL-10是反向调节因素,IL-1β和TNF-α使其增加,IL-NF可以再次被阻断-κB、 TNF-α的活化。
NF-κB活性指标也可作为炎症程度评估的标志。MAPK通道广泛存在于哺乳动物中,NF-κB是作用目标之一,广泛参与细胞炎症、增殖、分化、凋亡等方面。MAPK通道高度保守,每条通道都有三级激酶参与,触发多种生长因子、细胞因子、激素、蛋白质等因素。通过等级反应,部分细胞因子的分泌水平最终会发生变化,从而反映生物效应,影响炎症程度的变化和转化。MAPK通路的激活会增加许多导致炎症和免疫反应的细胞因子,如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等。P38MAPK通路在人类自身免疫中具有重要意义。紫外线辐射、激素、IL-1、TNF-αP38MAPK等细胞因子可以使核NF-κB复合体中的TATA结合蛋白质磷酸化,从而调节NF-κB的转录活动;JNK通路在炎症、凋亡和神经发育中起作用,它可以被辐射、环境因素和生长因素激活;ERK通道可以根据刺激强度和持续时间来调节细胞的增殖和分化。研究发现,大蒜素可以激活引导细胞[38]。因此,MAPK通路也可以成为抗炎治疗的目标,通过改变不同通路的活性,最终影响炎症的程度。因此,MAPK通道也可以成为抗炎治疗的目标,通过改变不同通道的活性,最终影响炎症的程度。在早期的动物实验中,我们发现大蒜素可以改变大鼠血清炎症因子的水平。
因此,通过影响MAPK通路活性,推测大蒜素可以减少NF-κB 将p65转移到细胞核中,达到调节炎症的目的。我们使用IL-1β在研究大蒜素对MAPK通路的作用时,可以模拟肠道炎症细胞的状态。大蒜素干预后,通过细胞上炎症因子检测,核蛋白NF-κB p65含量检测,明确大蒜素对细胞的抗炎作用;进一步检测细胞p38、ERK、JNK通路变化,推测大蒜素抗炎机制。本研究基于上述研究背景和理论基础,探讨了大蒜素在体内外IBD中的作用,以及大蒜素与MAPK通路的关系。
内容包括:
1、用TNBS诱导大鼠IBD模型;
2、观察美沙拉嗪和柳氮磺吡啶单独使用大蒜素的疗效;3、在IL-1βMAPK通路在诱导的Caco-2细胞中检测到大蒜素后发生变化。
方法1、80只Wistar大鼠分为空白对照组、TNBS模型组、大蒜素预防组(30mg/kg)、美沙拉嗪组(30mg//kg)、柳氮磺吡啶组(100mg//kg)、大蒜素灌胃组、美沙拉嗪大蒜素组、柳氮磺吡啶大蒜素组。造型前,大蒜素预防组用30mg/kg大蒜素灌胃,共2周。50mg//kg 灌肠TNBS乙醇溶液。模型24小时后,空白对照组、模型组和大蒜素预防组分别用生理盐水灌胃;美沙拉嗪组用30毫克/公斤艾迪莎混悬液灌胃;柳氮磺吡啶组用100毫克/公斤柳氮磺吡啶混悬液灌胃;大蒜素组用30毫克/公斤灌胃;美沙拉嗪与大蒜素组、柳氮磺吡啶和大蒜素组分别为两种混悬液,剂量相同;每天固定一次,持续14天。记录每组大鼠的体重变化,用肉眼和内镜观察结肠的一般变化,用光学显微镜观察结肠的病理变化。ELISA检测大鼠血清TNFF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。2、使用不同浓度和时间的大蒜素,选择Caco-2细胞株IL-1p处理细胞,MTT检测,确定安全范围。直径60mm的培养皿中接种细胞:孔白对照组,0.1ng/ml IL-1β组、1ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-1β组、10μg/ml大蒜素 1ng/mlIL-1β组、25μg/ml大蒜素 1ng/ml IL-1β组(含大蒜素组处理时,先加入大蒜素,加入IL-1p后,最终浓度为1ng/ml,持续培养至相应时间),每次培养12h、24h、48小时后,收集细胞上清和核蛋白。六孔板中的接种细胞分组:空白对照组、1ng/mlIL-1β组、25μg/ml大蒜素组,25μg/ml大蒜素 1ng/ml IL-1β组,培养24小时后收集细胞全蛋白。六孔板中的接种细胞分组:空白对照组、1ng/mlIL-1β组、25μg/ml大蒜素组,25μg/ml大蒜素 1ng/ml IL-1β组,培养24小时后收集细胞全蛋白。ELISA检测细胞上清IL-8水平;Western blot检测细胞核NFF-κB P65含量和MAPK各通道磷酸化水平的变化。3、统计:数据均用均数±标准差表示采用SPSS13.0统计软处理。组织评分数据对多个独立样本进行非参数检验(Kruskal-Wallis H Test)。测量数据比较,One用于方差的齐性-way ANOVA检验,LSD-t检验用于组间多重比较;方差不均匀时采用近似方差分析Welch法,Dunnetttt用于组间多重比较 T3检查;分析数据设计的方差分析用于细胞上清IL-8浓度。P<0.05表示差异显著,具有统计意义。结果1、大鼠体重:TNBS造型组2天后体重低于对照组。与造型模块相比,各治疗组大鼠体重增加。大蒜素灌胃组、柳氮磺吡啶、大蒜素组和美沙拉嗪联合大蒜素治疗组的体重没有显著差异;实验结束时,大蒜素灌胃组、美沙拉嗪组和美沙拉嗪联合大蒜素组的体重没有显著差异。2、组织HE染色评分:模块、大蒜素预防组、治疗组得分高于空白控制组,显示成功;与模块相比,大蒜素预防组和治疗组得分低于模块,显示预防和治疗具有显著的保护作用,与美沙拉嗪一起使用,组织得分最低。3、TNBS组大鼠血清TNF-α、IL-1β与空白组相比,水平显著提高;TNF治疗组-α、IL-1β与TNBS组相比,水平有所下降,但仍高于正常对照组;美沙拉嗪组和柳氮磺吡啶组没有显著差异;美沙拉嗪和大蒜素组含量最低。IL-4、IL-TNBS模块10水平显著降低;与模块相比,每个治疗组的IL-4水平均有所上升,但低于对照组,美沙拉嗪和大蒜素组的IL-4水平高于其他治疗组;IL-10级治疗组之间没有显著差异。4、IL-1梯度浓度β刺激Caco-2细胞12h、24h、ELISA在一定范围内检测到细胞上清IL-8的含量β浓度增加,作用时间延长。核蛋白westernnn blot分析见:NF-κB p65亚基含量随IL-11而增加β浓度增加。提前加入大蒜素干预后,核蛋白中的NF-κB 与对照组相比,p65亚基含量增加,但与1ng/ml IL-1β组,表达量下降,25μg/ml大蒜素组明显下降;但上清IL-8含量变化不大。该趋势在12h、24h、48h一致。5、1ng/ml IL-1β可以激活p38、ERK、JNK通道;提前2小时添加25μg/ml大蒜素会削弱p388、激活ERK通路,但可激活ERK通路;单独添加25μg/ml大蒜素不会引起p38、ERK通路可以激活JNK通路的变化。因此,当大蒜素抑制炎症时,p38、磷酸化JNK,增强ERK活化。
结论
探讨了大蒜素对体动物炎症性肠病模型的治疗作用,特别是与传统IBD治疗药物联合应用的疗效;并对离体肠上皮细胞的作用机制进行了部分研究。通过实验得出以下结论:1、大鼠结肠炎模型可以成功诱导TNBS。大蒜素灌胃可缓解造型引起的炎症,治疗效果优于预防效果。与美沙拉嗪和柳氮磺吡啶相比,单独应用效果没有显著差异,但大蒜素与美沙拉嗪联合应用后,炎症指标明显改善。2、IL-1β由于IL-8的升高,作用于Caco-2细胞可引起促炎,这种现象具有时间和浓度依赖性。单独用于Caco-2细胞的大蒜素不会引起IL-8的显著变化,而是提前用于IL-1β诱导的Caco-2细胞不会显著增加或降低IL-8含量。3、IL-Caco-2细胞核中诱导1p,NF-κB 随着浓度的增加,p65亚基含量会增加。单独用大蒜素刺激Caco-2细胞后,核NF-κB P65亚基含量没有明显变化;但大蒜素刺激Caco-2细胞2h后,用IL-1p诱导细胞,可见细胞核中的NF-κB IL-15亚基含量单独使用β细胞下降,增加大蒜素浓度可以增强这种效果。4、大蒜素可以抑制细胞中的p38、JNK、NF-κB通道激活可能是炎症因变化而引起的,并发挥抗炎作用
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